Хромосомы клеток слюнных желез личинки мотыля

Работа 4. Общая-характеристика гигантских хромосом

Гигантские политеновые хромосомы слюнных желез * удобнее приготовить из слюнных желез мотыля (см. работу 1), который крупнее ** , чем пригодная для этого 4-5-дневная выползающая личинка дрозофилы. Отпрепарованные слюнные железы погружают в каплю ацеторсеина (или ацестокармина) на 5-20 мин.

* ( Работа выполняется как факультатив кружковцами или отдельными учащимися.)

** ( Крупнее хромосомы мотыля — их длина 270 мкм.)

Краситель приготовляют заранее по следующей прописи: 1 г орсеина (или кармина) растворяют в 100 мл 45% уксусной кислоты. Эту смесь кипятят в колбочке (обернутой ватой и помещенной в водяную баню) на слабом огне от 30 мин до 1 ч. Затем закрывают горлышко колбочки ватным тампоном и на следующий день фильтруют (такая краска долго не теряет своих свойств).

Окрашенные слюнные железы переносят на чистое предметное и закрывают покровным стеклом. Поверх покровного стекла помещают маленький кусочек фильтровальной бумаги и осторожно раздавливают железы. Для заделывания раздавленных слюнных желез на них наносят каплю ацеторсеина, разбавленного уксусной кислотой (в соотношении 3:1), в которую добавляют маленькую капельку хлоралгидрата (5 мг на 2 мл воды). Затем окончательно покрывают препарат чистым покровным стеклом, края которого для лучшей герметизации заливают небольшим количеством расплавленного парафина. На холоде окраска препарата сохраняется около месяца.

Приготовленный препарат рассматривают при малом увеличении микроскопа (7×8). В центре клетки, где хромосомы расправлены, лучше можно обнаружить центромеру (хромоцентр) в виде более ярко окрашенного узла. От него отходят хромосомы, рассмотреть детали строения которых можно при больших увеличениях (см. рис. 26).

Хромосомы клеток слюнных желез личинки мотыля

Работа 1. Строение клетки животных

Живую животную клетку легко рассмотреть на одном из следующих объектов: клетки слюнных желез мотыля (личинки комара Chironomus plumosus * ), слюнных желез личинки плодовой мушки дрозофилы (Drosophila melanogaster), кожицы лягушки любого вида или слизистой оболочки ротовой полости человека.

* ( Если нет живого мотыля, его можно заготовить впрок (сроком на год), фиксируя в смеси 70° спирта. Перед работой его помещают на 2-5 мин в фиксатор и добавляют несколько капель 45-60% раствора молочной кислоты.)

Для выполнения работы требуется: микроскоп, предметные и покровные стекла, препаровальные иглы (по 2 на каждого учащегося), подкрашенные слабым раствором метиленовой синей (или фиолетовыми чернилами при отсутствии краски) растворы: для холоднокровных — 0,65% раствор NaCl (для работы с кожей лягушки), для теплокровных — 0,9% раствор NaCl (для работы с клетками слизистой оболочки ротовой полости человека), пипетки, спирт.

Рис. 56. Слюнные железы личинки А — мотыля (Chironomus); Б — дрозофилы (Drosophila melanogaster)

Препараты слюнных желез для демонстрации строения животной клетки (о препаратах хромосом слюнных желез см. в Работе №4) приготовляют следующим образом: вначале личинок обсушивают на фильтровальной бумаге (или промокашке) и положив на предметное стекло, разрывают тело личинки при помощи двух препаровальных игл (такие иглы можно приготовить самостоятельно из обычных швейных, если притупить их острый конец при помощи наждачной бумаги и, сильно нагрев со стороны ушка, ввести в деревянную палочку). По бокам пищеварительного тракта (в передней части тела личинки) хорошо заметна пара слюнных желез (рис. 56). Покрыв покровным стеклом эти железы (отделенные от прочих органов), каплю вытекшей из тела личинки гемолимфы рассматривают под малым увеличением. Видны крупные клетки с хорошо сформированными ядрами (рис. 57).

Рис. 57. Клетки слюнной железы мотыля (Chironomus)

Вместо этого объекта для рассмотрения живой клетки могут быть использованы кусочки кожи, обильно плавающие в виде тонких пленок в воде сосуда, где содержались лягушки.

При помощи пипетки перенести эту пленку на чистое предметное стекло, добавить каплю подкрашенного физраствора для холоднокровных и, расправив осторожно препаровальными иглами, покрыть чистым покровным стеклом. Рассматривать под микроскопом с увеличением объектива 40.

Клетки слизистой оболочки ротовой полости человека легко получить, осторожно проводя (предварительно тщательно протертым спиртом) тупым концом (рукояткой) скальпеля по внутренней поверхности щек или нижней губы. Такой соскоб помещают в капле подкрашенного физраствора для теплокровных на предметное стекло и закрывают сверху покровным. Увеличение объектива — 40.

Изучение политенных хромосом в клетках слюнных желез личинки комара

Хромосомы животных, обнаруживаемые на стадии метафазы, малы по размерам, компактны и не всегда доступны для тонкого аназиза. Цитологи открыли в некоторых соматических клетках особый вид хромосом — так называемые политенные хромосомы. Эти хромосомы в 100-200 раз длиннее и содержат намного больше хромонем, чем обычные метафазные.

Гигантские хромосомы были обнаружены итальянским цитологом Е.Бальбиани в слюнных железах комара хирономуса. Эти хромосомы возникают потому, что клетки не претерпевают деления, а лишь увеличиваются

в размерах. Так как хромонемы политенных хромосом репродуцируются без последующего расхождения, то каждая хромосома приобретает вид пучка хромонемных нитей, число которых достигает одной тысячи. При редупликации хромонем на хромосомах выявляются утолщения (диски), обусловленные либо более плотной спирализацией, либо наличием гранул в определенных участках. Диски могут быть различного размера и строения и их можно видеть при большом увеличении микроскопа. В каждой хромосоме эти диски имеют свои размеры и особенности расположения и являются морфологическими маркерами при изучении хромосом.

Цель занятия. Приготовить препараты слюнных желез личинки комара, рассмотреть их под микроскопом, подсчитать число хромосом и зарисовать их при малом и большом увеличении.

Приготовление препарата. Личинку комара помещают на предметное стекло в каплю физиологического раствора (0,73% раствор поваренной соли). Установив предметное стекло с личинкой на столик микроскопа, извлекают слюнные железы. Для этого одной препаровальной иглой прижимают туловище личинки, а другой иглой отделяют хоботок. Вместе с хоботком извлекают две слюнные железы в виде овальных плотных полупрозрачных телец. Железы с помощью препаровальной иглы переносят на другое предметное стекло для окрашивания. Окрашивают железы ацетаторсеином в течении 15-20 минут. После окрашивания препарат промывают в 45% уксусной кислоте, переносят на чистое предметное стекло, накрывают покровным стеклом и слегка придавливают. При этом следят чтобы покровное стекло не сдвигалось. Препарат рассматривают под малым увеличением микроскопа.

У комара кариотип составляет 6 хромосом. Гомологичные хромосомы коньюгируют, соединяясь попарно по всей длине. Поэтому в поле зрения видны клетки слюнных желез с тремя парами хромосом. При большом увеличении микроскопа можно видеть, что политенные хромосомы состоят из дисков, что создаёт видимость поперечных полос. (рис. 5). Диски могут быть различного размера и строения. Специфическое для каждой политенной хромосомы расположение и чередование дисков позволяет легко отличить её под микроскопом от других хромосом и опознать любой ее участок. При коньюгации гомологов в норме идентичные диски оказываются друг против друга.

Рис. 5.Часть гигантской полинемной хромосомы слюнной железы мотыля (пуф отмечен стрелкой)

Просмотрев препарат, находят клетки с более четко видимыми хромосомами и зарисовывают их при малом и большом увеличении.

Хромосомы клеток слюнных желез личинки мотыля

• Политенные хромосомы двукрылых характеризуются наличием серий полос-дисков, рисунок которых можно использовать в качестве цитологической карты

Интерфазные ядра в некоторых тканях личинок двукрылых мух содержат хромосомы во много раз большего размера, чем обычные хромосомы. У этих хромосом увеличены диаметр и длина. На рисунке ниже в качестве примера представлен хромосомный набор клеток слюнной железы D. melanogaster. Такие хромосомы называют политенными.

Каждая хромосома состоит из видимой серии полос-дисков (которые более правильно, но редко называют хромомерами). Существует примерно десятикратное различие в размере дисков. Наибольшая ширина составляет около 0,5 мкм, а наименьшая — 0,05 мкм. (Наименьшие диски видны только в электронном микроскопе.) В дисках находится большая часть массы ДНК, и они интенсивно прокрашиваются соответствующими красителями.

Участки между отдельными дисками окрашиваются светлее; их называют междисками. В хромосомном наборе D. melanogaster содержится около 5000 дисков.

Центромеры всех четырех хромосом D. melanogaster агрегируют с образованием хромоцентра, который в значительной степени состоит из гетерохроматина (а у самцов включает целиком Y-хромосому). С учетом этого можно считать, что около 75% гаплоидного набора ДНК организовано в диски и междиски. В растянутом состоянии эта ДНК представляет собой линейную структуру, длиной примерно 40 000 мкм. Длина всего хромосомного набора составляет примерно 2000 мкм, т. е. примерно в 100 раз превышает длину гаплоидного набора в митозе.

Это ясно показывает, в каком растянутом состоянии находится генетический материал в политенной хромосоме по сравнению с его обычными состояниями в интерфазном хроматине или в митотических хромосомах.

Политенные хромосомы D. melanogaster образуют серии дисков и междисков.

Какова структура этих гигантских хромосом? Каждая хромосома образуется в результате последовательных актов репликации конъюгировавшей пары гомологов. Реплики не разделяются, а остаются прикрепленными друг к другу по всей длине. В начале процесса каждая конъюгировавшая пара содержит количество ДНК, равное 2С (где С — это содержание ДНК в одной индивидуальной хромосоме). Затем число удвоений происходит до 9 раз; в результате максимальное содержание ДНК может достигнуть 1024С. Число удвоений варьирует в различных тканях личинки D. melanogaster.

Каждая политенная хромосома видна в виде большого числа параллельных нитей, сильно сконденсированных в дисках и слабее в междисках. Вероятно, каждая такая нить представлена единичной копией (С) гаплоидной хромосомы. Отсюда и происходит термин «политения». Степень политении определяется числом гаплоидных хромосом, содержащихся в гигантской хромосоме.

Для каждой линии Drosophila характерен свой набор дисков. Постоянство числа и линейного расположения дисков впервые было отмечено в 1930-х годах, когда стало понятно, что диски образуют цитологическую карту хромосом. В результате перестроек — таких как делеции, инверсии или дупликации, — происходит изменение линейного порядка дисков.

Линейный порядок дисков соответствует линейному расположению генов. Таким образом, генетические перестройки, как это видно по карте сцепления, можно привести в соответствие со структурными перестройками на цитологической карте. В конечном итоге, конкретную мутацию можно локализовать в определенном диске. Поскольку общее число генов у D. melanogaster превышает число дисков, в большинстве дисков, вероятно, локализуется множество генов.

Положение определенных генов на цитологической карте можно определить непосредственно с помощью метода гибридизации in situ. Общая схема метода представлена на рисунке ниже. Радиоактивная проба, представляющая некий ген (чаще всего меченный клон кДНК, полученный с иРНК), гибридизуется с денатурированной ДНК политенных хромосом in situ. Методом радиоавтографии можно определить местоположение одного или нескольких исследуемых генов по скоплению зерен серебра в области одного или нескольких дисков. Недавно вместо радиоактивных зондов стали использовать флуоресцентные.

Используя этот метод, оказывается возможным непосредственно выявить полосу, в которой локализована специфическая последовательность.

Индивидуальные диски, содержащие определенные гены, можно идентифицировать методом гибридизации in situ. При большом увеличении показана гибридизация in situ на дисках 87А и 87С с меченной ДНК,
выделенной из клеток, подвергнутых действию теплового шока.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Гигантские (политенные) хромосомы

В клетках некоторых дифференцированных органов двукрылых находятся так называемые гигантские хромосомы. Впервые эти хромосомы в 1881 г. описал Е. Бальбиани в клетках слюнных желез мотыля (Chironomus). В дальнейшем такие гигантские хромосомы были обнаружены у личинок двукрылых в ядрах клеток кишечника, мальпигиевых сосудов, а также у некоторых растений в ядрах синергид, например у гороха. Гигантские хромосомы в 100-200 раз длиннее и в 1 000 раз толще (содержат до I 000 хромо нем), чем хромосомы многих интерфазных соматических и половых клеток.

У личинок Drosophilae melanogaster общая длина четырех пар хромосом в слюнных железах составляет 2 000 мкм, а в обычных соматических клетках аналогичная величина — 7,5 мкм.

Характерные форма и размеры гигантских хромосом достигаются вследствие их максимальной деспирализации и многократного воспроизведения без последующего расхождения. Этот процесс — крайнее выражение так называемого эндомитоза. Благодаря тому что реплицированные хромонемы не расходятся, все особенности индивидуальной хромонемы, в частности ее хромомерный рисунок, оказываются более контрастно выраженными. Участки более плотной спирализации хромонем (хромомеры) на гигантских хромосомах представлены в форме поперечной исчерченности дисков. Такие политенные хромосомы далее не воспроизводятся и находятся в состоянии соматической конъюгации гомологов, достигающей идеальной точности. Диски и междисковые участки гомологов расположены строго параллельно и на большом протяжении хромосом тесно сближены. Такая конъюгация не характерна для хромосом подавляющего большинства соматических клеток. Возможность четко различать детали строения гигантских хромосом была использована Т. Пайнтером для изучения их перестроек и характера конъюгации хромосом.